Главная → Анализы → Иммунологический метод → Реакции гемагглютинации (иммунологический метод)
Содержание
Реакции гемагглютинации (иммунологический метод)
Реакции агглютинации основаны на взаимодействии реагента (антител) с антигенами, находящимися на поверхности клеток или инородных частиц. В результате образуются агрегаты крупного размера, которые выпадают в осадок и их можно увидеть даже невооруженным глазом. Таким образом определяют группу крови по системе АВО, наличие в ней резус-фактора и др. Это более чувствительный по сравнению с реакциями преципитации способ диагностики, так как объем осадка (агглютината) превосходит объем преципитата.
Прямая гемагглютинация
Реакция прямой гемагглютинации (РПГА) используется для выявления поверхностных антигенов микроорганизмов и эритроцитов, а также антител к ним.
К стандартным сывороткам, содержащим антитела, добавляют исследуемый материал (кровь). Скорость прямой реакции агглютинации связана с количеством исследуемого материала, количеством и концентрацией сыворотки, температурой окружающей среды.
Непрямая гемагглютинация
Реакцию непрямой гемагглютинации проводят для выявления антител в крови пациента с помощью эритроцитарного диагностикума. Реагент представляет собой эритроциты, на поверхности которых расположен антиген (белки микроорганизмов, токсинов, аллергенов и др.).
Сыворотку крови пациента разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, затем добавляют эритроцитарный диагностикум и отслеживают результат. Этот высокочувствительный способ диагностики выявляет антигены даже в небольших концентрациях.
категории раздела
Реакция гемагглютинации (РГА).
В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.
Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.
Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не
антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.
Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.
Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+».
Реакция гемагглютинации
Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.
Реакция торможения гемагглютинации
Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.
Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.
Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.
Реакция непрямой гемагглютинации
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.
Постановка реакции. Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.
Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.
Контрольные вопросы.
1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?
2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.
Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.
Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний , вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.
РКС-сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.
Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.
Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой , то во второй системе гемолиза не будет- т.к. нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.
Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").
Компоненты, реакции связывания комплемента :
1. Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,
реже взвесь микроорганизмов.
2. Антитело — сыворотка больного.
3. Комплемент — сыворотка морских свинок.
4. Антиген — эритроциты барана.
5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.
6. Изотонический раствор.
Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,
они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.
Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 1736 | Нарушение авторских прав
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.
1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.
Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых планшетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".
2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.
Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум?
Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.
В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.
Методика постановки реакций. Реакция коагглютинации.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
— фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
— обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
— сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Реакция коагглютинации (РКА)
Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум).
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Агглютинирующие сыворотки: что они содержат; как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки?
содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены.
Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7—8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител.
Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом.
Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.
В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам?
Монорецепторные сыворотки — сыворотки, содержащие антитела только к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции агглютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими общий антиген. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они способны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат антитела к бактериям, имеющим общие антигены.
Реакция гемагглютинации. Описание и применение
Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА — на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк — реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
- фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
- обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
- сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:
- к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
- смесь оставляют на 2—3 ч при комнатной температуре или на 16—18 ч при 4 °С;
- учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.
РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
- обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
- обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Вконтакте
Google+
Одноклассники