Метод флюоресцирующих антител принцип метода

Иммунофлуоресцентный анализ (МФА — метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) (англ. Immunofluorescence) — набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных так и внутриклеточных белков и рецепторов. Исследование и оценка может выполняться вручную при помощи флюоресцентного микроскопа или автоматизировано с использованием проточного цитометра (flow cytometer) или микрочипового цитометра (сhip cytometer). Возможно применение конфокального микроскопа и роботизированного флюоресцентного микроскопа (в том числе совмещенных с проточным цитометром) в сочетании с программной системой обработки изображений. Имеющиеся в настоящее время автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце примерно 50 различных антигенов с использованием набора различных флюоресцентных маркеров в формате высокоинформативной микроскопии и цитометрии (методы носят названия high-content imaging, high-content cytometry, high-content screening) и примерно вдвое меньшем максимальным набором антигенов с использованием современной проточной цитометрии или конфокальной микроскопии. Основными практическими приложениями являются онкология, микробиология, клеточная биология, генетика, фармакология и др.

Сущность и классификация метода[ | код]

Сущность метода заключается в визуализации антигена специфическими антителами с флуоресцентными маркерами. Метод конъюгации глобулинов с органическими флюорохромами разработан в 1942 году А. Кунсом (англ.)русск..[1] В настоящее время метод использует как антитела к различным антигенам, так и специфические красители к ДНК (к примеру DAPI), РНК (к примеру Sybr Green II), липидам и белкам.

В базовой МФА методике различают прямой метод, разработанный А. Кунсом и Мелвином Капланом,[2] и непрямой, разработанный А. Кунсом и Уиллером в первоначальном варианте непрямого МФА с комплементом.

При прямом методе (пМФА) на исследуемый препарат или в суспензию клеток наносят раствор прямо меченых флюоресцентным красителем антител. Образование комплекса антиген-антитело обнаруживается флюоресцентным сигналом в виде свечения разной степени интенсивности и четкости.

При непрямом методе (нМФА) на препарат наносят антитела против искомых антигенов (т. н. «первые» антитела), а затем видоспецифичные «вторые» антитела против «первых» антител, что позволяет избежать неспецифических реакций. При этом только вторые антитела коньюгированны с флюоресцентным красителем. К примеру, если при исследовании в качестве «первых» антител используются мышиные антитела — mouse IgG, то в качестве «вторых» используются антивидовые anti-mouse IgG коньюгированные с флюоресцентным красителем. Комплекс антиген-антитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания со «вторым» антителом.

Непрямые методы требуют наличия только антиглобулиновых видовых сывороток с флюорохромами, но при этом необходимо большое количество тестовых контролей. При постановке прямым методом делается только один контроль, хотя в более ранних версиях метода требовалось множество моноспецифических сывороток. Долгое время недостатками прямых видов МФА являлись ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующих глобулинов на различных элементах препарата. В настоящее время используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие иммуноглобулины к исследуемым антигенам. Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая степень очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции, что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие метода.

Поскольку прямой метод в настоящее время позволяет избежать неспецифических реакций, автоматизированные методики преимущественно используют прямой метод иммунофлуоресценции.

Результаты ручной микроскопической оценки описываются в так называемых «крестах» (от одного + до четырёх ++++) — субъективная градация степени выраженности реакции глазом исследователя. В автоматизированных методах в качестве детектора используются фотоумножители или высокочувствительные флуоресцентные фотокамеры, что позволяет регистрировать сигнал с большой точностью и дает значение относительного уровня флюоресценции (relative fluorescence ratio) в широком диапазоне шкалы. Абсолютное значение высчитывается с помощью контролей или антигенов с известным постоянным содержанием в образце. При использовании автоматизированных методов обработка данных осуществляется специализированными программами для обработки изображений и анализа цитометрических данных.

Значение и перспективы метода[ | код]

Метод имеет решающее значение в ранней диагностике и лечении онкологических заболеваний (иммуногистохимия, онкогематология), диагностике инфекционных заболеваний (например определение CD4+ клеток при ВИЧ) и наследственных синдромов. Интенсивно развиваются автоматизированные методы, среди которых направления высокоинформативной микроскопии (high content imaging) и высокоинформативной цитометрии(high content cytometry),параллельно развивающиеся с 90х годов комбинированные методики цитометрии-микроскопии (цитометр-микроскоп), а также методы микрочиповой цитометрии с плазмонной голографией [3] в которых отдельные антитела метятся наночастицами.

Примечания[ | код]

1. ↑A. H. Coons, H. J. Creech, R. N. Jones, E. Berliner (нем.)русск., The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody, J. Immunol.45, 1942, pp. 159—170
2. ↑A. H. Coons, M. H. Kaplan, Localization of antigen in tissue cells. II. improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody, J. Exp. Med., 91(1), pp. 1-13
3. ↑On-Chip Cytometry using Plasmonic Nanoparticle Enhanced Lensfree Holography : Scientific Reports : Nature Publishing Group

Метод флуоресцирующих антител (МФА) (иначе реакция иммунофлуоресценции – РИФ) используется для обнаружения антигенов в биологических объектах (микроорганизмах, жидкостях) с помощью антител, помеченных флуоресцирующими красителями.

Первый люминесцентный микроскоп с кварцевой оптикой был сконструирован еще в 1908г. Келером и Зидентопфом. Сам метод иммунофлуоресценции был изобретен в 1942г. А. Кунсом, синтезировавшим органический краситель флуоресцеин-4-изоцианат, и  разработавшим методику его конъюгирования с сывороточными белками.

Различают прямой (пМФА) или  реакция  прямой иммунофлуоресценции  (РПИФ), разработан. А Кунсом и Каплан. Непрямой (нМФА) метод флуоресцирующих антител или  реакция непрямой иммунофлуоресценции  (РнИФ), разработан Кунсом и Уиллером и, как разновидность последнего нМФА с комплементом.

ПМФА  используется с  целью выявления антигенов в биологических пробах на основе известных сывороток.

Методика пМФА. На предметном стекле фиксируется мазок или отпечаток ткани, содержащий антиген. На этот мазок наносится флуоресцирующая сыворотка, содержащая антитела против предполагаемого антигена. В качестве контроля используется гетерологичная флуоресцирующая сыворотка. В течение 30 мин.мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С затем их промывают, удаляя лишний флуоресцин. Сыворотка, связываясь с антителом, образует комплекс, включающий флуоресцин, как опознавательный маркер. Оценка результатов осуществляется люминесцентным микроскопированием  по уровню яркости зеленого свечения, описывается в крестах.

“+++++” – яркая, сверкающая флуоресценция;

“+++” – отчетливо выраженная, достаточно яркая флуоресценция;

“++” —  флуоресценция  слабая, но морфология   клеток   и   цвет  люминесценции выявляется достаточно четко;

“+” —  флуоресценция  очень   слабая,   морфология   клеток различима плохо;

“-” – флуоресценция отсутствует.

НМФА используется с целью выявления специфических антител в биологических пробах.

Методика нМФА. При проведении нМФА на известный, фиксированный на стекле антиген, наносят испытуемую сыворотку и в течение 30 мин. мазки с нанесенной сывороткой выдерживают во влажной камере при +37°С. Затем наносят антивидовой (соответствующий     испытуемой  сыворотке) люминесцирующий  гамма-глобулин и  вновь  выдерживают во влажной камере. Далее препараты промывают, высушивают и исследуют люминесцентной микроскопией. Титром сыворотки считают то наибольшее ее разведение, которое обусловливающее свечение на “++”,  при наличии свечения на “+++” или “++++” в предыдущем разведении.

Модификацией нМФА, является нМФА с комплементом. В этом случае к сыворотке, нанесенной на антиген, добавляется комплемент, а к нему уже антикомплементарная люминесцирующая сыворотка.

Преимуществом непрямых методов является необходимость наличия только видовых люминесцирующих сывороток. При этом реакция становится более громоздкой из-за большого количества необходимых контролей. К недостаткам всех видов РИФ относится ограниченная чувствительность из-за наличия возможных перекрестных реакций между близкими по антигенному составу объектами и неспецифическая флуоресценция вследствие адсорбции флуоресцирующей сыворотки на различных элементах препарата.

РИФ применяется в настоящее время для идентификации возбудителей различных вирусных инфекций, бешенства,  колиэнтеритов, дизентерии, гепатита, брюшного тифа и паратифов, холеры, коклюша, чумы, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, сифилиса, токсоплазмоза, хламидиоза, и др.

Для лабораторных исследований используются коммерческие стандартные конъюгаты, содержащие глобулины к исследуемым антигенам.

Список литературы:

1. Р. Кирк Д. Бонагура Современный курс ветеринарной медицины Кирка. М., “Аквариум” 2005г.

2. Х.Г. Ниманд  П.Ф. Сутер Болезни собак. М., “Аквариум” 1998г.

3. Бусыгин К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных М., “Колос” 1975г.

4.Сюрин В.М Самуйленко А.Я. и др.

Метод флуоресцирующих антител

Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП 2004г.

5. Ветеринарная микробиология и иммунология под ред. Проф. Н.А.Радчука М., “Агропромиздат” 1991г.

Еще интересные статьи

В рубрике "Для владельцев"

Лабораторная диагностика

Метод непрямой флюоресценции (реакция непрямой иммунофлюоресценции — РНИФ) обладает рядом преимуществ по сравнению с РИФ. Ее используют не только для определения антигенов, но и для титрования антител; реакция обладает большей чувствительностью, так как позволяет с помощью одной и той же антивидовой меченой сывороткой обнаружить различные бактериальные и вирусные антигены при применении в каждом случае на первом этапе постановки реакции немеченых специфических иммунных сывороток.

Метод флуоресцирующих антител (МФА)

Определение специфических антител РНИФ является основным методом диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом, широко применяется для диагностики заболеваний, передающихся половым путем.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в два этапа: первый — взаимодействие антител с антигеном, второй — ферментативная индикация комплекса антиген — антитело за счет появления окрашивания реакционной смеси и регистрации окрашивания визуально либо спектрофотометрическим методом.

Существуют два варианта ИФА: твердофазный и жидко-фазный, различающиеся по способу разделения компонентов иммунохимической реакции. По сравнению с описанными ранее методами выявления антигенов и антител ИФА обладает существенными преимуществами:

— высокой чувствительностью, позволяющей определять до 0,05 нг/мл вещества;

— возможностью использования минимальных объемов исследуемого материала (1—2 мкл);

— возможностью инструментального или визуального учета реакции;

— экспрессностью и возможностью автоматизации всех этапов реакции.

ИФА в настоящее время широко используют в практике для диагностики многих инфекционных болезней бактериальной, грибковой этиологии, протозойных инфекций и гельминтозов, но особенно вирусных инфекций, в частности гепатитов А, В, С, D, Е, G, ВИЧ-инфекции, герпесвирусных, ротавирусных, аденовирусных, астровирусных, парвовирусных и других инфекций.

Иммунный блоттинг

Принцип метода иммунного блоттинга состоит в выявлении антител к отдельным антигенам возбудителя. С помощью этого метода определяют антитела к антигенам ВИЧ (гликопротеинам оболочки вируса, белкам сердцевины и ферментам вируса). Результаты иммунного блоттинга оценивают как положительные, сомнительные и отрицательные в зависимости от количественного и качественного набора выявленных антител.

Необходимо отметить, что иммунный блоттинг уступает по чувствительности ИФА, в некоторых случаях может регистрироваться отрицательный результат при наличии ВИЧ-инфекции у пациента. Однако возможность регистрации лож-ноположительных результатов в ИФА при ВИЧ-инфекции требует комплексного подхода в диагностике ВИЧ-инфекции с учетом, помимо результатов иммунологических реакций (ИФА, иммунный блоттинг), эпидемиологических и клинических данных.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод ПЦР был разработан американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 г. на основе применения открытой им термостабильной ДНК-полимеразы (Tag-полимеразы). Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемого in vitro ДНК-по-лимеразой в автоматическом режиме.

В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического для определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликонов) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

Описанное выше комплементарное достраивание цепей начинается только в определенных стартовых блоках, представляющих собой короткие двунитевые участки. При присоединении таких блоков к специфическим участкам ДНК процесс синтеза новой цепи направляется только в выбранном участке, а не по всей длине цепи ДНК. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют две олиго-нуклеотидные затравки, которые называют праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы так, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.

К достоинствам метода ПЦР следует отнести:

— высокую чувствительность, позволяющую определять 10—1000 клеток в пробе;

— высокую специфичность, поскольку в исследуемом материале выявляется уникальный для данного возбудителя фрагмент ДНК;

— универсальность процедуры обнаружения различных возбудителей из одной биопробы;

— высокую скорость анализа (4—4,5 ч);

Перейти на страницу: 3456789

Принцип иммунофлуоресценции. Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специфичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно использовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуоросцеина (FITC), дающий зеленовато-желтое окрашивание.

Иммунофлюоресценция – чувствительный и достаточно простой тест. В качестве субстрата при непрямой иммунофлуоресценции применяется монослойфиксированных и пермобилизированных клеток-мишений, нанесенных на стеклянные пластинки (слайды). Слайды инкубируют с сывороткой больных при наличии соответствующих Ат в тестируемой сыворотке происходит взаимодействие Аг–Ат. После первой инкубации клетки промываются, чтобы избавиться от несвязавшихся Ат, и вторично инкубируются с моноклональными Ат IgG человека, меченными FITC. Оценка результатов производится с помощью микроскопии в люминесцентном режиме при увеличении в 400 раз (см. рис. 10.1). Для определения типа свечения и спектра аутоАТ используют соответствующие контрольные сыворотки и стандарты, содержащие определенные Ат.

Рисунок 10.1 Принцип флуоресцентной микроскопии

Метод непрямой иммунофлуоресценции – качественный и полуколичественный. Оцениваются интенсивность свечения, тип флуоресценции и титры. Интенсивность свечения определяется 1+, 2+, 3+, 4+ по шкале интенсивности (4+ – положительный контроль набора). Полуколичественная оценка получается серией разведений тестируемой сыворотки до конечной точки, при которой флуоресценции не наблюдается.

Антинуклеарные АТ (antinuclearantibodies, ANA) – гетерогенная группа аутоАт, преимущественно класса IgG, реагирующих с различными компонентами ядра (ДНК, гистонами, РНК, центромерами и др.) и цитоплазматическими антигенами. Выявление ANA методом непрямой иммунофлуоресценции позволяет диагностировать аутоиммунную патологию и проводить дифференциальную диагностику на ранних этапах между системными заболеваниями соединительной ткани (СЗСТ) и неаутоиммунными заболеваниями при схожей клинической картине. Кроме того, на основе данного метода, в зависимости тех или иных аутоАт в сыворотке крови больных можно проводить дифференциальную диагностику внутри группы СЗСТ.

Наиболее часто для их определения используется тест непрямой иммунофлюоресценции. Для постановки реакции непрямой иммунофлуоресценции в качестве субстрата для аутоАт используют HЕp-2 клетки, культуру эпителиальных клеток ларингокарциномы человека. И ядро, и нуклеоли в этих клетках большие, хорошо распознаются, в них хорошо различаются ядерные структуры. HEp-2-клетки могут быть применены для определения как ядерных, так и цитоплазматических АГ. Живые HЕp-2 клетки, находящиеся в интерфазе клеточного цикла, нанесены монослоем на слайды и позволяют выявлять аутоантитела к 30 различным нуклеарным и цитоплазматическим структурам. В настоящее время известно более 100 разновидностей ANA.

Чаще всего в сыворотке больного содержится более чем одно специфическое Ат, что проявляется смешанными типами флуоресценции. При трудности описания типа свечения проводится дальнейшее разведение тестируемой сыворотки, что позволяет уточнить наличие тех или иных АТ. Определение аутоАТ, выявляемые в сыворотки крови больных, на HEp-2-клетках дают соответствующие типы свечения. Различают шесть основных типов иммунофлуоресцентного свечения:

1. Гомогенное свечение (см. рис.10. 2-А) – однородное диффузное свечение внутри ядра с окрашиванием нуклеолей или без них. Данный тип свечения обусловлен наличием Ат к оцДНК, дцДНК, гистонам. Наиболее часто наблюдается при системной красной волчанке, ревматоидном артрите, ювенильном ревматоидном артрите, лекарственной волчанке.

2. Периферическое ядерное (см. рис. 10.2-B) – равномерное гомогенное свечение с кольцевидным свечением по периферии ядра. Характерно при наличии Ат к дцДНК, белкам, составляющим интегральную часть ядерной мембраны (ламины А, В, С) или против интегральных белков ядерно-порового комплекса GP210.

3. Спектральное (крапчатое ядерное) свечение (см. рис. 10.2-С) характеризуется крапчатым или зернистым свечением всей нуклеоплазмы. Ат, дающие такое свечение, направлены против большого семейства негистоновых АГ. Может быть от мелкоточечной (тонкой) зернистости до крупных гранул, одинаковой либо различной формы.

МЕТОД ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА). ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Это свечение наблюдается при связывании Ат с компонентами ядерного матрикса: гетерогенным ядерным рибонунуклеопротеидом (hnRNP), U1-RNP/Sm. Также это свечение дают Ат к SS-A/Ro и SS-B/La, встречаемые при синдроме Шегрена.

4. Нуклеолярное свечение (см. рис. 10.2-D) – свечение нуклеолей, наблюдается при наличии Ат к фибриларину (одному из белков, связывающихся с U3 малым рибонуклеопротеидом), РНК-полимеразе-1 и ДНК-топоизомеразе-1 (Scl-70), нуклеолину или РМ/SclАг. Выявление таких аутоАт характерно для прогрессирующей системной склеродермии.

5. Центромерное (дискретное пятнистое) – однородное дискретное свечение локализуется повсюду внутри ядра, обычно кратное число пятнышек приблизительно 46 (40–60 зернышек в ядре). Данный тип свечения связан с Ат к центромерам хромосом. Встречается при системной склеродермии, первичном билиарном циррозе.

6. Цитоплазматическое свечение может быть разнообразного характера: рибосомальным, лизосомальным, митохондриальным или тонко зернистым. Например, тонкие гранулы, располагающиеся вокруг ядра и уменьшающиеся по направлению к периферии цитоплазмы, свидетельствуют о наличии Ат к аминоацил-тРНК-синтетазе (Jo-1) (см. рис. 10.2-Е). Такие аутоАт встречаются при дерматомиозите.

(А). Гомогенный тип свечения (анти-ssDNA АТ)

(B). Периферическое ядерное свечение (анти-dsDNA АТ)

(С). Крапчатое ядерное свечение (анти-Sm АТ)

Рисунок 10.2 Типы иммунофлуоресцентного свечения при использовании HEp-2-клеток

Проведение реакции при определении АNA

1. Развести концентрат фосфатного буферного раствора (PBS). 1 часть конц. РВS + 19 частей дистиллированной воды. Хранить только 1 мес. при температуре 2–80ºС. Например: 5 мл концентрата + 95 мл воды.

2. Развести сыворотки:

а) скрининг (разведение 1:40, например, 25 мкл + 975 мкл РВS),

б) титрование (серия разведений 1:40, далее 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 и т. д., например: 500 мкл сыворотки разведенной 1:40 + 500 мкл PBS дает разведение 1:80 и т. д.).

(D). Нуклеолярное свечение (анти Scl-70 АТ)

(Е). Цитоплазматическое свечение (антиJo-1 АТ)

Рисунок 10.2 Типы иммунофлуоресцентного свечения при использовании HEp-2-клеток (продолжение)

3. Развести концентрат фосфатного буферного раствора (PBS). 1 часть конц. РВS + 19 частей дистиллированной воды. Хранить только 1 мес. при температуре 2–80ºС. Например: 5 мл концентрата + 95 мл воды.

4. Развести сыворотки:

а) скрининг (разведение 1:40, например, 25 мкл + 975 мкл РВS),

б) титрование (серия разведений 1:40, далее 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 и т. д., например: 500 мкл сыворотки разведенной 1:40 + 500мкл PBS дает разведение 1:80 и т. д.).

5. Достать слайды из пакета и дать достичь комнатной температуры (+18–20ºС) в течение 30 мин. Затем положить слайды во влажную камеру и добавить одну каплю каждого разведения и контролей в 1, 2 и 3 лунку соответственно. Добавить 25 мкл разведенной сыворотки пациента в оставшиеся лунки.

6. Слайды инкубировать в течение 30 мин во влажной камере при комнатной температуре.

7. Достать слайды из влажной камеры и промыть, окунув в РВS, в течение 5–10 минут. Промывать осторожно, не направлять струю прямо на лунки при промывке пипеткой.

8. Добавить флуоресцирующий коньюгат: стряхнуть излишек РВS и промокнуть слайды фильтровальной бумагой (вокруг лунок). Возвратить слайды во влажную камеру, НЕМЕДЛЕННО в каждую лунку добавить по 1 каплю коньюгата. Высохший субстрат искажает результаты.

9. Инкубировать в течение 30 мин. во влажной камере при комнатной температуре в темноте.

10. Промыть слайды (см. пункт 7).

11. Оптимальное контрастирование: добавить 2–3 капли 1% Эванс блю в 100 мл РВS (до погружения слайдов в буферный раствор).

12. Достать слайды из буферного раствора. Быстро просушить вокруг лунок фильтровальной бумагой и добавить в каждую лунку по 1 капле среды для покрытия. Осторожно покрыть слайд покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха.

13. Смотреть под люминесцентным микроскопом.

Интерпретация результатов:

• Титры ANA, полученные при разведении тестируемой сыворотки, оцениваются следующим образом: до 1:80 – низкие титры; 1:160–1:640 – средние титры; более 1:640 – высокие титры. Титр ANA выше 1:80 считается предположительным для СЗСТ.
• Частота выявления определенных аутоАт к различнымАг при различных нозологических формах СЗСТ варьирует, так для системной красной волчанки более характерны АТ к дцДНК, для синдрома Шегрена – Ат к SS-A/Ro, а системной склеродермии – АТ к Scl-70.
• Уровень ANA отражает активность и характер течения СЗСТ. Существует прямая корреляционная зависимость между тирами ANA и активностью заболевания. Чем более агрессивно протекает системная красная волчанка, тем выше уровень аутоАТ. Изменение тиров ANA в динамике через 3, 6 и 12 месяцев служит одним из критериев оценки эффективности проводимой терапии.

Дата публикования: 2015-09-18; Прочитано: 374 | Нарушение авторского права страницы

studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год.(0.003 с)…

При данном методе используют явление люминесценции.

Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300—460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей — МЛ-1—МЛ-4, «Люмам».

В вирусологической практике применяют два основных метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител (или РИФ).

Флуорохромирование — это обработка препаратов флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их. Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот. Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая — рубиново-красным.

Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:

• готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;
• препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);
• окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного — контроль.

Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод (одноступенчатый). На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

Непрямой метод (двухступенчатый). На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела. На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С. Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку.

Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток.

Тема №15. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Реакция нейтрализации (РН).

Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента. Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ. К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Вконтакте

Google+

Одноклассники

Тема №15. Метод флуоресцирующих антител (МФА). Реакция нейтрализации (РН).

Цель занятия: изучить серологические реакции (реакцию нейтрализации), метод флуоресцирующих антител, технику выполнения и учет результатов

Материалы и оборудование: сыворотка крови, штатив с пробирками, фиксаторы.

Метод флуоресцирующих антител (МФА).

Возможности данного метода обусловлены специфичностью первой фазы серологических реакций с высокой чувствительностью люминесцентного анализа. Для осуществления МФА необходимо иметь высокоспецифические иммунные люминесцирующие сыворотки. Известно, что в различных серологических реакциях, используемых в микробиологической практике, участвуют преимущественно три компонента: бактерийный антиген, антитело и комплемент. Все три компонента, по сути, являются антигенами, и против каждого из них могут быть получены иммунные сыворотки и, соответственно, люминесцирующие антитела. В зависимости от того, какого типа люминесцирующую сыворотку используют (против бактерийного антигена, антибактериальных антител, комплемента), различают три основных варианта метода флуоресцирующих антител: прямой (1) и непрямой (2) варианты и модификация непрямого варианта с использованием комплемента. Иммунологическая реакция между антигеном и антителом осуществляется в этих модификациях непосредственно на предметном стекле. Для фиксации микроорганизмов применяют органические растворители: ацетон, этанол, метанол, диоксан, а также обычные фиксаторы, используемые в микробиологической практике: формалин, смесь Никифорова, жидкость Карнуа и др.

Прямой вариант. На готовый препарат наносят специфическую люминесцирующую сыворотку на определенное время, затем излишек сыворотки сливают, препарат промывают и просматривают в люминесцентном микроскопе. Этот метод применяют для обнаружения бактерий в патологическом материале, объектах внешней среды, а также для идентификации возбудителей заболеваний в культурах.

Непрямой (двухступенчатый) вариант. На первом этапе происходит специфическое соединение антигена с соответствующим антителом немеченой сыворотки. На втором этапе специфическое немеченое антитело связывается с антивидовым люминесцирующим антителом, содержащимся в сыворотке животного, иммунизированного глобулинами (или цельной сывороткой крови) того вида животных, от которых была использована иммунная сыворотка.

Непрямой антикомплементарный (трехступенчатый) вариант. Первый этап: образование комплекса антиген — немеченое антитело. Второй этап: наслаивание нормальной сыворотки, содержащей комплемент.

Иммунофлуоресцентный анализ

Третий этап: комплекс антиген — антитело — комплемент обрабатывают люминесцирующей антикомплементарной сывороткой, приготовленной при иммунизации кроликов сывороткой того вида животного, которое служило источником комплемента.

Непрямые варианты МФА можно использовать как для выявления антигенов, так и для определения антител. Кроме того, для постановки двухступенчатого варианта нужно иметь ограниченный набор антивидовых люминесцирующих сывороток (против глобулинов быка, барана, лошади, свиньи и др.), а для антикомплементарного варианта достаточно иметь всего одну люминесцирующую сыворотку против глобулинов морской свинки.

Методика иммунолюминесцентной микроскопии. В практике ветеринарных бактериологических лабораторий используют люминесцирующие сыворотки биофабричного производства. В зависимости от типа флуорохрома люминесцирующие сыворотки обеспечивают либо зеленое свечение объекта (краситель на основе флуоресцеина), либо красное (краситель на основе родамина).

Для проведения иммунолюминесцентной микроскопии следует на обезжиренное тонкое без царапин предметное стекло нанести исследуемый материал. При исследовании органов и тканей животных готовят препараты-отпечатки тонким слоем. Препараты подсушивают на воздухе и помещают в фиксирующую жидкость (этанол — 15 мин, метанол — 5 мин, ацетон — 5 мин). Если необходимо, после фиксации препараты некоторое время можно сохранять в холодильнике. Последовательность и дальнейшие процедуры зависят от применяемого варианта МФА

Реакция нейтрализации. Используется только для определения принадлежности бактерийных токсинов в исследуемом материале для установления активности антитоксических сывороток. В пробирки с равным количеством антигена (в 1мл, например, 1000 смертельных доз столбнячного токсина) добавляют равный объем убывающего количества (убывающей концентрации) специфической гипериммунной антитоксической сыворотки; пробирки помещают в термостат на 1-2 ч. Затем из каждой пробирки смесь-токсин-антитоксин вводят лабораторным животным (по 2 животных на каждую дозу антитоксина). Животные, которым ввели смесь, где произошла нейтрализация токсина, остаются живыми. Наименьшее количество сыворотки, нейтрализовавшее токсин, принимается за единицу активности антитоксической сыворотки (АЕ)

Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 185 | Нарушение авторских прав

Похожая информация:

Поиск на сайте: